Trong khi cốt truyện trò chơi được trình bày thông qua nhân vật chính Desmond Miles, phần lớn thời gian trò chơi được chơi bởi những trải nghiệm của Desmond về ký ức của một trong ba Altaïr, Ezio hay Connor qua cỗ máy Animus. Điều này cung cấp vài phương tiện cho người chơi, thể hiện thanh máu của Altaïr hay Ezio, vật dụng, thiết bị, mục tiêu và một số tính năng khác thuộc Animus. Animus hoạt động dựa vào người chơi, mà ở đây là Desmond, điều khiển sát thủ để duy trỳ sự đồng bộ giữa Desmond và các tổ tiên của anh ta. Làm những hành động mà đi ngược lại với cách của sát thủ hoặc bị chết thì Animus sẽ dừng đồng bộ, và người chơi phải chơi lại ở checkpoint trước đó. Thêm vào đó, người chơi không thể đi đến những khu vực mà sát thủ chưa từng đặt chân đến. Ngoài ra còn có những điều kì lạ như những ký tự do subject trước để lại.

Trong quá trình chơi vào vai sát thủ, game thường được trình diễn qua góc nhìn người thứ ba trong một thế giới mở, tập trung vào hành động lén lút và parkour. Game sử dụng kiến trúc nhiệm vụ để hoàn thành hết cốt truyện, thường là những nhiệm vụ yêu cầu hoàn thành ám sát những mục tiêu đầu não hoặc là những nhiệm vụ mang tính bí mật. Bên cạnh đó là những nhiệm vụ phụ, chẳng hạn như mở rộng bản đồ thành phố bằng cách leo lên những mái nhà cao tầng nhất định và thục hiện một cú "Leap of Faith" (cú nhảy của niềm tin), thu thập kho báu được ẩn giấu khắp thành phố, khám phá những tàn tích hay di vật, xây dựng một tình huỳnh đệ sát thủ để thực hiện các nhiệm vụ, hay chi tiền hoặc tái xây dựng lại thành phố thông qua giao thương và nâng cấp các cửa tiệm, quầy hàng buôn bán. Thông qua giao diện của Animus, người chơi được phép chơi lại những nhiệm vụ trước mặc dù đã hoàn thành xong, ví dụ như Assassin's Creed: Brotherhood, người chơi sẽ đạt được kết quả đồng bộ tốt hơn nếu như hoàn thành xuất sắc những yêu cầu riêng trong màn chơi như chỉ tiêu diệt duy nhất mục tiêu của nhiệm vụ.

Game sử dụng khái niệm di chuyển "chủ động" đối đầu với "bị động", trong đó "chủ động" là những hành động như chạy, leo lên tường, trèo lên mái nhà, nhưng có thể gây sự chú ý đến các lính gác lân cận. Một khi quân lính đang trong tình trạng báo động, người chơi một là quay lại chiến đấu với chúng, hai là thoát khỏi vòng vây và ẩn nấp những nơi mà chúng không nhìn thấy, chẳng hạn như chui vào đống rơm hay cái giếng, và chờ cho sự cảnh giác của chúng suy giảm. Hệ thống chiến đấu trong game khá đa dạng với những vũ khí lạ, áo giáp và những đòn ra chiêu cực kì lợi hại, bao gồm việc sử dụng hidden blade được buộc ở phía cánh tay trong của sát thủ. Vũ khí này rất giúp ích cho việc ám sát lén lút.